学术成果 | Cancers：利用尿液检测尿路上皮癌—一种新的甲基化标志物+点突变模型

导读

膀胱尿路上皮癌（UBC）是最常见的尿路恶性肿瘤之一，全球每年约有573278例新发病例和212536例死亡。UBC的典型诊断和监测涉及使用膀胱镜检查、尿细胞学和FISH。膀胱镜检查被视为检测UBC的金标准，但由于其侵入性，患者接受度较低。而尿液细胞学和FISH缺乏敏感性，尤其是在低级别肿瘤中。基于目前诊断的现状，需要开发可替代的非侵入、高性能的检测方式来检测UBC。

DNA甲基化是调控基因表达的表观遗传机制之一，异常的DNA甲基化也是肿瘤发生过程中的早期事件。这可能指示DNA甲基化模式的改变是肿瘤早期可检测的分子变化之一，并有助于癌症的检测。湘雅三医院王龙教授团队与大地同年生物合作，通过对尿液样本检测，构建了一种基于单基因甲基化并结合两个点突变的检测模型，在膀胱尿路上皮癌的诊断上表现出高度特异性和稳定性，可作为UBC检测的替代方法。近日，该研究成功发表于Cancers(IF=6.575)期刊。

文章链接：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36765573/

研究内容

本研究通过生信分析筛选了七个甲基化生物标志物，使用尿沉淀进行了三个阶段的分析，以构建和评估标志物组合的诊断性能。首先使用NGS鉴别出每个甲基化生物标志物的排名前六的高甲基化区域（队列1；n=52），并使用MS-PCR验证了这些区域（队列2；n=69）。其次使用概念验证研究队列（队列3；n=240）构建了一个诊断组合。此外，该研究通过结合甲基化加点突变两种突变生物标志物来提高诊断组合的诊断性能。最后，使用盲法队列（队列4；n=82）对诊断模型进行外部验证，评估了甲基化加点突变检测组合的稳定性和重现性，并与尿细胞学和荧光原位杂交（FISH）进行了比较。

图1：研究涉及的流程图

主要研究结果

1、使用NGS和MS-PCR验证7个甲基化生物标志物

NRN1在7个生物标志物中显示出最高的AUC，AUC值为0.9796。在最佳阈值为5.16时，单个NRN1生物标志物的诊断灵敏度为0.93，特异性为0.97。研究使用Boruta特征选择算法根据7个甲基化生物标志物的重要性对其进行排序，并使用随机森林算法突出显示队列2中用于区分UBC和良性对照的最佳组合。但该组合性能并不优于单个NRN1。因此，选择单一NRN1生物标志物进行湖南多中心验证。

2、NRN1甲基化生物标志物加点突变，作为诊断工具区分UBC与良性对照

从之前的研究中检索了五个与UBC相关的基因，使用NGS方法在湖南多中心队列中检测到这些基因的突变。只有TERT C228T（228_G_A）和FGFR3 p.S249C（568_C_G）在区分UBC和对照组方面表现出良好的性能。应用湖南多中心队列中NRN1、TERT C228T和FGFR3 p.S249C的Δct值，使用随机森林算法构建一个新的组合。该模型对pTa、pT1、pT2、pT3和pT4肿瘤的检测敏感性分别为0.916、0.875、0.85、0.75和0.80。此外，该模型的诊断准确性不受肿瘤分级的影响，在检测低级别和高级别肿瘤方面表现出相似的性能。

图2. 队列3中不同SNP位点的热图。参数“condition”表示蓝色为良性对照，红色为UBC肿瘤样本。

3、模型的外部验证及与FISH和尿细胞学的对比

从北京单一中心招募了82名可疑UBC受试者，进行外部验证。甲基化加点突变检测组合模型实现了极好的区分，总体AUC为0.935，敏感性为0.864，特异性为0.895。对于低级别和高级别肿瘤的检测，该模型的敏感性分别为0.867和0.862。此外，该模型与常规细胞学和FISH相比，表现出更高的敏感性和可比的特异性。